Aquí explicaré como definir la transparencia en una imagen GIF.
1. Deberemos escoger nuestra imagen a la cual le daremos transparencia en algún lado. En mi caso, para mostrar el resultados, le aplicaré una transparencia en el borde.

2. Una vez escogida tu imagen, deberás empezar a dibujar las zonas que quieras que sean transparente en una nueva capa (o layer), ya sea con el Polygonal Lazzo Tool o solo con Rectangular Marquee Tool. Luego de dibujar las zonas de transparencia, deberás llenarlas con un color fuerte (ya sea verde claro o azulino). De preferencia, que sea un color que no tenga la imagen. Recuerda tener seleccionada la zona que quieras que sea transparente. Una vez rellena con el color puedes desactivar la selección (tener seleccionado nada).
NOTA: deben ser dibujadas en una nueva capa, ya que sino alterarás la imagen.
3. Una vez definida tu zona de transparencia deberemos ir a: "Image -> Mode -> Indexed Color". Te aparecerá un mensaje, le das a OK. Luego te aparecerá otra pantalla, la cual deberás presionar OK (en otras palabras, dejas todo igual).
4. Ahora todo depende de la versión de Photoshop que tengas, ya que este es el ultimo paso. Describiré las dos maneras.
Primera Forma
Vas a "File -> Export -> GIF89a Export". Te aparecerá una pantalla donde deberás definir el color transparente presionando sobre el.

Luego presionas OK y te saldrá la ventana de "Guardar como...". Le pones un nombre y listo.
Segunda Forma
Vas a "File -> Save for the web as". Te saldrá una pantalla parecida a la que está arriba. Así que es solo repetir el mismo paso: definir el color que será transparente y darle a OK. En todo caso, aquí dejo una imagen del menú que debería salirte.

5. El resultado deberá ser el siguiente: